Sadañoski, Marcela Alejandra;
Purificación y caracterización parcial de la enzima lacasa obtenida de peniophora sp. nativo de Misiones - Posadas: Universidad Nacional de Misiones. Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales, 2012. - 52 p.: tab.; gráf.
Trabajo final para obtención de título: Bioquímico/a
La madera y otros materiales lignocelulósicos representan la mayor fuente de energía y materia orgánica renovables de la biósfera. Sus principales constituyentes son la lignina, la celulosa y la hemicelulosa.
La degradación de la lignina es el resultado de reacciones oxidativas inespecíficas en enzimas, presentes principalmente en los hongos de pudrición blanca. Las enzimas ligninolíticas incluyen la manganeso peroxidasas, lignina peroxidasas y las lacasas.
Las lacasas (benzenediol: oxígeno oxidoreductasa, EC 1.10.3.2) son polifenoles oxidasas que catalizan la oxidación de compuestos fenólicos y aminas aromáticas usando de oxígeno molecular como aceptor de electrones. Recientemente, ha sido sugerido que también oxidan compuestos no fenólicos en presencia de un mediador. Son multicobre oxidasas azules que contienen de 2 a 4 átomos de cobre por molécula y están ampliamente distribuidas en plantas, bacterias y hongos.
El hongo de pudrición blanca Peniophora sp. como parte de su sistema oxidativo produce principalmente la enzima lacasa. Asimismo es conocido que en presencia de cobre, se se secretan dos enzimas, una enzima constitutiva de 60 kDa y otra, inducible, de 75 kDa.
El objetivo del trabajo fue purificar y caracterizar parcialmente las enzimas lacasas secretadas por Peniophora sp. Para ello. el primer procedimiento fue obtener estas enzimas puras. Para ello se puso a punto el procedimiento de purificación, se plantearon tres estrategias y se eligió la más conveniente. Luego, se procedió a la determinación de los parámetros cinéticos: Km1, Vmáx2, Kcat, y Kcat/Km.
Los métodos utilizados en la purificación fueron filtración, precipitación con sulfato de amonio, ultrafiltración, cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de exclusión molecular. La estrategia 2 resultó ser la más conveniente, dando los mejores valores de pureza y rendimiento de las otras dos restantes. Esta consistió en la preparación de la muestra, cromatografía de exclusión molecular y cromatografía de intercambio iónico.
Las enzimas puras de 60 kDa y 75 kDa, se expusieron a distintas concentraciones del sustrato 2,6-dimetoxifenol y se calcularon los parámetros cinéticos. El análisis de los parámetros cinéticos revela que la enzima de 60 kDa tiene mayor capacidad oxidativa que la lacasa de 75 kDa con el sustrato DMP y que ambas poseen una eficiencia catalítica similar.
LACASA
HONGOS
MADERA
CROMATOGRAFÍA DEAE-CELULOSA
CROMATOGRAFÍA EN GEL
MISIONES (PROVINCIA)
Peniophora sp.
Purificación y caracterización parcial de la enzima lacasa obtenida de peniophora sp. nativo de Misiones - Posadas: Universidad Nacional de Misiones. Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales, 2012. - 52 p.: tab.; gráf.
Trabajo final para obtención de título: Bioquímico/a
La madera y otros materiales lignocelulósicos representan la mayor fuente de energía y materia orgánica renovables de la biósfera. Sus principales constituyentes son la lignina, la celulosa y la hemicelulosa.
La degradación de la lignina es el resultado de reacciones oxidativas inespecíficas en enzimas, presentes principalmente en los hongos de pudrición blanca. Las enzimas ligninolíticas incluyen la manganeso peroxidasas, lignina peroxidasas y las lacasas.
Las lacasas (benzenediol: oxígeno oxidoreductasa, EC 1.10.3.2) son polifenoles oxidasas que catalizan la oxidación de compuestos fenólicos y aminas aromáticas usando de oxígeno molecular como aceptor de electrones. Recientemente, ha sido sugerido que también oxidan compuestos no fenólicos en presencia de un mediador. Son multicobre oxidasas azules que contienen de 2 a 4 átomos de cobre por molécula y están ampliamente distribuidas en plantas, bacterias y hongos.
El hongo de pudrición blanca Peniophora sp. como parte de su sistema oxidativo produce principalmente la enzima lacasa. Asimismo es conocido que en presencia de cobre, se se secretan dos enzimas, una enzima constitutiva de 60 kDa y otra, inducible, de 75 kDa.
El objetivo del trabajo fue purificar y caracterizar parcialmente las enzimas lacasas secretadas por Peniophora sp. Para ello. el primer procedimiento fue obtener estas enzimas puras. Para ello se puso a punto el procedimiento de purificación, se plantearon tres estrategias y se eligió la más conveniente. Luego, se procedió a la determinación de los parámetros cinéticos: Km1, Vmáx2, Kcat, y Kcat/Km.
Los métodos utilizados en la purificación fueron filtración, precipitación con sulfato de amonio, ultrafiltración, cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de exclusión molecular. La estrategia 2 resultó ser la más conveniente, dando los mejores valores de pureza y rendimiento de las otras dos restantes. Esta consistió en la preparación de la muestra, cromatografía de exclusión molecular y cromatografía de intercambio iónico.
Las enzimas puras de 60 kDa y 75 kDa, se expusieron a distintas concentraciones del sustrato 2,6-dimetoxifenol y se calcularon los parámetros cinéticos. El análisis de los parámetros cinéticos revela que la enzima de 60 kDa tiene mayor capacidad oxidativa que la lacasa de 75 kDa con el sustrato DMP y que ambas poseen una eficiencia catalítica similar.
LACASA
HONGOS
MADERA
CROMATOGRAFÍA DEAE-CELULOSA
CROMATOGRAFÍA EN GEL
MISIONES (PROVINCIA)
Peniophora sp.